摘要：近年来，国内外对石油及兵产品的微生物降解研究常见报道，却鲜见机油废水微生物降解方面的研究。本试验目的是通过常规微生物驯化方法，以市售机油为唯一碳源，从油污土壤中分离筛选出机油高效降解菌株，并对其生长条件及降解特性进行研究，以期进一步应用于含油污水的治理。
关键词：微生物 机油污染废水 微生物降解
近年来，国内外对石油及兵产品的微生物降解研究常见报道，却鲜见机油废水微生物降解方面的研究。本试验目的是通过常规微生物驯化方法，以市售机油为唯一碳源，从油污土壤中分离筛选出机油高效降解菌株，并对其生长条件及降解特性进行研究，以期进一步应用于含油污水的治理。
1 材料与方法
1．1 土壤样品
某石油库贮油罐附近的石油污染土壤，取样3份，按含油量由多至少编为1＃，2＃，3＃。
1．2 培养基
本试验选取两种无机基础培养基，（用蒸馏水配制并高压蒸气灭菌），编号分别为1＃，2＃，组成如下：
1＃基础培养基：p（KH2PO4）＝0.5g／L，ρ（K2HPO4）＝0.5g／L，P（MgSO4·7H2O）=0.2g／L，ρ（NaCl）=0.2g／L，p（CaCl2）＝0.1g／L，ρ（NH4NO3）＝1.0g／L，MnSO4痕量，FeCl3痕量。
2＃基础培养基：p（NaNO3）=2.0g／L，ρ（KH2O4）＝0．2g／L，ρ（MgSO4.7H2O）＝0.2g／L，ρ（酵母浸膏）＝1.0g／L．
含油培养基是向上述无机基础培养基中加入适量机油。固体培养基中加入质量分数为0．2％的琼脂。
1．3 优势菌筛分试验
1．3．1 选择富集培养
称取土样各10g，加入到500mL1＃含油培养基（含机油4mL）中，调pH值7.0，通气恒温30℃培养48h后，分别移取上述培养液5mL于45mL1＃，2＃含油培养基（含机油2mL）中，恒温30℃振荡培养。
1.3.2 平板分离
制作1＃，2＃固体含油培养基平板苦干，用接种环蘸取振荡培养较好的菌液在相应平板划线，恒温30℃培养48h后平板划线分离，重复数次。选择生长状况良好的菌株进行平板扩大培养。
1．4 生长条件正交试验
在保证供氧和氮、磷营养前提下，选择温度。油的质量浓度（以mg／L计）和pH值作为本次实验的三个因素进行三水平实验，方案见表1、表2。将平板培养48h的菌体刮下，5000r／min离心5min，分离得到湿菌体。向方案中每个样品加入0.5g湿菌体，培养60h后测定样品中油的质量浓度。
表1 ZL1菌株正交试验方案及试验结果
分组号 因素 测定结果ρ（油）/（mg.L-1) 降解测量ρ（油）/（mg.L-1)
温度/ ρ（油）/（mg.L-1) pH值
1 25 424 5.0 192 232
2 25 680 7.0 416 264
3 25 824 9.0 630 194
4 30 424 7.0 220 204
5 30 680 9.0 507 173
6 30 824 5.0 654 170
7 35 424 9.0 297 127
8 35 680 5.0 569 111
9 35 824 7.0 755 69
K1 690 563 513
K2 547 548 537
K3 307 433 494
K1 230 188 171
K2 182 183 179
K3 102 144 165
R 128 44 14
表2 ZL2菌株正交试验方案及试验结果
分组号 因素 测定结果ρ（油）/（mg.L-1) 降解测量ρ（油）/（mg.L-1)
温度/ ρ（油）/（mg.L-1) pH值
1 25 368 4.0 69 299
2 25 574 6.0 267 307
3 25 767 8.0 479 288
4 30 368 6.0 354 314
5 30 574 8.0 296 278
6 30 767 4.0 462 305
7 35 368 8.0 142 226
8 35 574 4.0 342 232
9 35 767 6.0 548 219
K1 824 769 766
K2 897 817 840
K3 677 812 792
K1 275 256 255
K2 299 272 280
K3 226 271 264
R 73 16 25
1.5 降解能力试验
配制机油质量浓度为270mg／L的含油培养基1L，投入小型间歇反应器中，加入离心分离得到的湿菌体5g，通气恒温30℃培养，间隔12h取样测定其含油量。
1．6 测试方法
用紫外介光光度法测定。
2 结果分析
2．1 优势菌筛分试验
富集培养过程中，1＃土样的培养液出现的泡沫较多，乳化现象明显，菌液也较为粘稠，分离出较多的菌株，说明土壤中的石油烃能刺激石油降解菌的生长。经过选择富集培养、平板分离出4株以机油为唯一碳源的菌株，编号为ZL1，ZL2，ZL3，ZL4，性状见表3。进一步培养后筛选出降解性能较好的ZL1（1＃培养基）和ZL2（2＃培养基）进行正交试验和连续培养试验。
表3 4株机油降解菌形态特征
形态特征 ZL1 ZL2 ZL3 ZL4
菌落颜色 粉红 淡黄 淡黄 粉红
菌落形态 不透明，微隆起，全缘， 半透明，圆形 半透明，圆形，隆起， 不透明，米粒状突起，
光滑，有光泽 光滑，较干燥 光滑，有光泽 较湿润
菌体形态 短杆 球形 杆状 丝状
菌体大小/μm （0.3-0.8)×(0.6-1.0） Φ0.3 （0.5-0.8)×(1.3-5.0) 0.2×(6-60)
革兰氏染色 G G G G
初步鉴定 黄杆菌属 微球菌属 假单胞菌属 酵母菌属
2．2 生长条件正交试验
ZL1，ZL2菌株按设定的正交试验方案进行试验，测定其剩余含油量，以降解油量作为考察指标，计算结果见表2、表3。分析极差值R可以看出：ZL1菌的R温度为128，ZL2菌的R温度为73，均为最大极差值，说明温度是影响降解效果的主要因素。25℃ZL1菌降解机油能力较强；油质量浓度越低降解效果越好；pH值为7时，降解效果最好，说明ZL1菌适于在中性条件下生长。30℃ZL2菌降解机油能力较强；机油的质量浓度在368-767mg／L范围内对降解效果影响不大，以ρ（油）=574mg／L时降解效果最明显，还应进一步扩大试验的油含量范围以确定油含量对ZL2菌降解能力的影响；pH值在4－8范围内对降解效果的影响也不显著，其中PH值为6时降解效果最好，说明ZL2菌较适于在中性偏酸条件下生长。
2.3 降解能力试验
向1L油质量浓度为270mg／L培养液中投加5g湿菌体进行间歇培养，考察ZLI，ZLZ菌的降解能力，结果见图1。由含油量与培养时间关系曲线可以看出：ZL1，ZL2菌被加人含油培养基后很快适应环境，随着培养时间的增长，含油量不断下降。ZL1菌在30h左右去除率达到最大，后含油量下降缓慢，到60h左右曲线趋于平直；ZL2菌在20h左右去除率达最大，48h左右曲线趋于平直。曲线说明ZL1，ZL2菌适应能力较强，ZL1菌在0－60h内生长旺盛对机油的去除率可达67．9％，ZL2菌在0－48h内生长旺盛，对机油的去除率高达76.2％，试验后期降解曲线趋于平直，含油量基本不再变化，可能是由于机油中的一些重组分难于降解的原因。
3 结论
①石油污染土壤较适于做高效石油降解菌驯化菌源。筛选到两株高效机油降解菌ZL1，ZL2。通过正交试验得出ZL1黄杆菌属适于在25℃，油的质量浓度在424mg／L左右，中性条件下生长。ZL2微球菌属适于在 30℃，油的质量浓度在574mg/L左右，中性偏酸条件下生长。
②温度对ZL1，ZL2菌的机油降解能力影响较大。ZL2菌的PH值、机油浓度适应范围较广，有较好的应用前景。
③ZL1，ZL2菌对初始机油质量浓度为270mg／L培养液的去除率分别达到67.9％和76.2％，混合菌株的降解效果有待进一步研究。